O uso de testes sorológicos em peixes

Similar aos animais terrestres, os peixes contam com um sistema imune composto pela imunidade inata e adaptativa que atuam em conjunto na proteção contra diferentes agentes infecciosos ou toxinas. Considerada um componente essencial no combate inicial de patógenos, a imunidade inata é representada por barreiras físicas (escamas, tegumento, muco e trato gastrointestinal), fatores humorais (lisozimas, proteínas do sistema complemento e anticorpos naturais) e diferentes células (neutrófilos, natural killers e macrófagos). Por sua vez, a imunidade adaptativa atua a partir do contato prévio com o patógeno, sendo responsável por montar uma resposta especifica composta por fatores celulares (linfócitos T, B e macrófagos) e os humorais, no qual fazem parte as imunoglobulinas (Ig) ou anticorpos. Os principais anticorpos encontrados nos peixes são a IgM, IgD e IgZ/T, sendo a IgM o primeiro tipo de anticorpo a ser expresso e o mais abundante no soro dos peixes (Uribe et al., 2011, Buchmann e Secombes, 2022).

Baseado nisso, os anticorpos são um dos principais alvos de detecção dos chamados métodos sorológicos. Estes métodos são representados por diferentes técnicas que buscam detectar e/ou quantificar anticorpos e substâncias presentes em fluidos como o muco, soro e tecido dos peixes. O princípio associado à essa detecção resulta da ligação que ocorre entre os anticorpos do hospedeiro e o antígeno, por exemplo, patógenos (Jaramilo et al., 2017, Kibenge et al., 2016).

 Tradicionalmente, os métodos sorológicos são constantemente empregados em animais terrestres para atender diferentes propósitos, tais como demonstrar a ausência de infecção por patógeno ou o progresso de um programa de erradicação de doença; certificar da ausência de infecção em animais antes de movimentá-los para outras regiões; estimar a prevalência de uma infecção no plantel; confirmar casos suspeitos de doença e demonstrar a eficácia de uma vacinação (Cullinane e Garvey, 2021). Nos peixes, relatos ocasionais utilizando testes sorológicos foram realizados a partir de 1960. Sugere-se que devido a presença de respostas imunes inespecíficas desses animais e opiniões negativas baseadas na discordância de resultados entre sorologia e métodos de detecção direta do patógeno (por exemplo, biologia molecular) para diagnóstico e vigilância de doenças nos peixes, foi concebido uma visão pessimista e um uso restrito dos testes (Jaramillo et al., 2017). Além disso, a falta de avaliação da performance dos métodos (sensibilidade e especificidade analítica, diagnóstica e outros) podem ter contribuído para seu uso limitado.

Contudo, após três décadas, ocorreu um crescimento acentuado no número de estudos sobre a utilização dos testes sorológicos em peixes, principalmente na pesquisa da resposta imune resultante do efeito de dietas imunomoduladoras; influência de parâmetros de qualidade de água (por exemplo, temperatura, pH, sólidos suspensos, salinidade e oxigênio dissolvido) na imunidade humoral e diagnóstico de patógenos (Jaramillo et al., 2017). Adicionalmente, alguns testes têm sido frequentemente utilizados na detecção e mensuração de títulos de anticorpos contra bactérias e vírus durante o desenvolvimento de vacinas e, ocasionalmente, na determinação do status vacinal, frequência de vacinação e até mesmo como método alternativo para teste de potência de vacinas comerciais para algumas espécies de peixes (Holten-Anderson et al.,2012, Liu et al., 2016, Romstad et al., 2014).  Os métodos comumente utilizados, bem como o princípio de cada um deles e sua utilização em peixes estão descritos na tabela 1.

Tabela 1. Método sorológico, princípio da técnica e aplicação em peixes.

Método	Princípio	Aplicação
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou Ensaio de Imunoabsorção Enzimática	Reação antígeno-anticorpo detectada através do complexo de enzima e cromógeno.	- Avaliação da resposta imune humoral após vacinação. - Diagnóstico de doenças virais e bacterianas;
Aglutinação	Formação de aglomerados entre antígeno-anticorpos visíveis a olho nu ou no microscópio.	- Avaliação da resposta imune humoral após vacinação.
Fixação do Complemento	Reação antígeno-anticorpo detectada através de reação secundária com lise celular ou floculação.	- Titulação de anticorpos contra patógenos bacterianos.
Soroneutralização	Ligação entre anticorpos e agentes viriais para inativação do efeito citopático do vírus.	-Monitoramento de doença viral.
Teste de Hemaglutinação	Reação entre eritrócitos contendo antígenos na superfície e anticorpos, seguido da sedimentação e formação de aglomerados visíveis.	- Indicador de resposta imune adaptativa.
Imunoflourescência	Reação anticorpo-antígeno detectada pela emissão de luz.	- Diagnóstico de infecção por patógenos bacterianos e virais.
IDGA (Imuno difusão em gel de ágar)	Reação visualizada em uma matriz de ágar com zonas com precipitados de antígenos-anticorpos.	- Avaliação da resposta imune humoral após vacinação. - Detecção de anticorpos contra agentes virais.
Análise de proteínas por Western Blotting	Reação antígeno-anticorpo ocorre através de membrana onde os componentes do antígeno são separados por uma eletroforese.	- Detecção de proteínas imunogênicas para desenvolvimento de vacinas.

Fonte: Adaptado de Jaramillo et al. (2017).

Na prática, a utilização dos métodos sorológicos é realizada principalmente a partir da obtenção do soro de animais vacinados, doentes ou portadores de doença infecciosa sem sinal clínico, a fim de detectar a presença de anticorpos contra o patógeno de interesse. De maneira geral, o sangue do peixe é coletado por venopunção da veia caudal, submetido a centrifugação para separar o soro dos outros componentes contidos no sangue e, em seguida, utilizado nos testes como os descritos na tabela 1. A figura 2 ilustra de maneira resumida as principais etapas para realização de um teste sorológico (ELISA) em peixes.

Figura 2 – Principais processos realizados para avaliação sorológica em peixes. Etapa 01: coleta de sangue por venopunção da veia caudal em juvenil de tilápia do Nilo vacinado. Etapa 02: obtenção e coleta de soro (seta vermelha) após centrifugação do sangue. Etapa 03: utilização do soro em um teste de ELISA para detecção de anticorpos contra bactéria em animais vacinados (Fonte: acervo pessoal)

Os testes sorológicos possuem diversas vantagens quando utilizados para atender diferentes propósitos, como diagnóstico de doenças e em programas vacinais. Primeiro, alguns testes não necessitam realizar eutanásia dos animais para coleta de amostra, principalmente em situações em que esta prática é inviável em alguns grupos de animais, como reprodutores, especialmente pelo elevado valor genético e econômico destes animais no cultivo. Permite também a avaliação de animais em larga escala para a detecção de peixes portadores que não apresentam sinal clínico de doença, sendo uma ferramenta ideal para programas de controle de doenças infecciosas. Além disso, nos programas vacinais, possibilita a avaliação de um mesmo animal em diferentes momentos de coleta de amostra.

Diante disso, os métodos sorológicos são ferramentas imprescindíveis para a avaliação da resposta imune humoral dos peixes no desenvolvimento de vacinas e nos programas vacinais, principalmente para detectar ou quantificar anticorpos produzidos contra o antígeno após a imunização. Rotineiramente, a Inata Biológicos utiliza testes sorológicos tanto em animais terrestres, como aves, quanto em peixes, principalmente na análise da resposta imune de animais vacinados com imunobiológicos em desenvolvimento e em estudos de eficácia vacinal de vacinas autógenas utilizadas a campo por meio de parceria com outros laboratórios.

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Referências Bibliográficas

• BUCHMANN, K, SECOMBES, C.J. Principles of Fish Immunology: From Cells and Molecules to Host Protection. In Principles of Fish Immunology, pp. 670, 2022.

• CULLINANE, A., GARVEY, M. A review of diagnostic tests recommended by the World Organisation for Animal Health Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial  Animals. OIE Revue Scientifique et Technique, 40, 75–89, 2021. https://doi.org/10.20506/rst.40.1.3209

• HOLTEN-ANDERSEN, L., DALSGAARD, I., NYLÉN, J., LORENZEN, N., BUCHMANN, K. Determining vaccination frequency in farmed rainbow trout using Vibrio anguillarum O1 specific serum antibody measurements. PLoS One, 7(11), 1–6, 2012. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049672

• JARAMILLO, D., PEELER, E. J., LAURIN,E., GARDNER, I. A., WHITTINGTON, R. J. Serology in Finfish for Diagnosis, Surveillance, and Research: A Systematic Review. Journal of Aquatic Animal Health, 29(1), 1–14, 2017. https://doi.org/10.1080/08997659.2016.1244577

• KIBENGE, F.S.B., GODOY, M.G., KIBENGE, M.J.T. Diagnosis of Aquatic Animal Viral Diseases, in: KIBENGE, F.S.B., GODOY, M.G. (Eds.), Aquaculture Virology. Academic Press, Kidlington, 49–75, 2016. https://doi.org/10.1016/c2014-0-00125-6

• LIU, G., ZHU, J., CHEN, K., GAO, T., YAO, H., LIU, Y., ZHANG, W., LU, C. (2016). Development of Streptococcus agalactiae vaccines for tilapia. Diseases of Aquatic Organisms, 122(2), 163–170, 2016. https://doi.org/10.3354/dao03084

•  ROMSTAD, A. B., REITAN, L. J., MIDTLYNG, P., GRAVNINGEN, K., EMILSEN, V., EVENSEN, Ø. Comparision of a serological potency assay for furunculosis vaccines (Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida) to intraperitoneal challenge in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Biologicals, 42(2), 86–90, 2014. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2013.11.007

• TORT, L., BALASCH, J.C., MACKENZIE, S. Fish immune system. A crossroads between  innate and adaptive responses. Inmunologia, 22, 277–286, 2003

• URIBE, C., FOLCH, H., ENRIQUEZ, R., MORAN, G. Innate and adaptive immunity in teleost fish: A review. Veterinární Medicína (Praha), 56, 486–503, 2011. https://doi.org/10.17221/3294-VETMED